申请日2008.03.28

公开(公告)日2008.08.27

IPC分类号G01N21/17; C12Q1/04; G06F19/00

摘要

本发明提供了一种人工湿地污水处理系统微生物活性检测方法，包括人工湿地微生物取样、培养、萃取、测定和计算的基本步骤，本发明采用碘硝基四氮唑作为电子受体，基于INT的强电子亲和性取消除氧步骤，培养时间为2h，以乙醇为萃取剂常温提取微生物细胞内的INTF。本发明的积极效果体现在：INT的电子亲和力大，与氧竞争电子能力强，并可用于检测人工湿地系统中好氧、厌氧及反硝化脱氮微生物的电子传递体系活性，在常温条件下完成萃取过程，避免了高温产生的萃取不完全、萃取剂蒸发等问题;将微生物干重直接测定法与微生物电子传递活性检测过程相结合，避免了因基质和植物根际生物量不同和取样不均而导致的误差。

权利要求书

1. 一种人工湿地污水处理系统微生物活性检测方法，其特征在于，依 次包括如下步骤：

(1)从人工湿地污水处理系统中取出附着微生物的植物根须或基质， 超声振荡5～10min，收集脱落的生物膜，用水稀释至浓度为5～6g/L，获 得微生物悬浊液;

(2)将Tris-HCl缓冲溶液和重量浓度为1.0～3.0mg/mL的碘硝基四氮 唑(溶液加入步骤(1)的微生物悬浊液，然后置于35～37℃下，暗处振荡 培养1～2h，获得培养物;

体积比为：

微生物悬浊液∶Tris-HCl缓冲溶液=1∶1.5～2;

微生物悬浊液∶INT=1∶1～2;

(3)向步骤(2)的体系中，加入1mL甲醛溶液，终止酶反应，然后， 过滤，收集滤饼;

甲醛溶液的体积浓度为35～37%，加入的体积比为：

步骤(2)的培养物∶甲醛溶液=1∶0.2～0.3;

(4)向滤饼中加入乙醇，搅拌，在35～37℃下，暗处振荡萃取5～10min， 然后过滤，收集萃取液，然后在分光光度计的485nm处，以加入0.1～0.2ml 间甲酚的样品为空白对照，测定待测样品的INTF萃取液吸光度;

(5)计算结果，采用式(1)计算人工湿地污水处理系统微生物电子 传递体系活性：

INT - ETSA = OD 485 × V K × t × W - - - ( 1 )

式中，INT-ETSA为微生物电子传递体系活性[mg/(g·h)];

OD485为波长485nm处的上清液吸光度;

V为萃取剂体积(mL);

K为标准曲线斜率;

t为培养时间(h);

W为微生物样品质量(g)。

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，标准曲线的制作方法如 下：

1)准确称取0.050g INTF定容于50mL茶色容量瓶中，此溶液即为 1mg/mL的INTF标准溶液。

2)分别吸取1mg INTF/mL标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7， 0.8，0.9，1，2mL加于50mL茶色容量瓶中，再用乙醇分别稀释至50mL， 摇匀，于是得到每毫升含有0.002，0.004，0.006，0.008，0.010，0.012，0.014， 0.016，0.018，0.020，0.040mg INTF的系列溶液。

3)在721分光光度计的485nm处，用光程1cm的比色皿，以乙醇作 为空白溶液，测定上述11种浓度溶液的吸光度。

4)将上述11种浓度溶液与相应的吸光度作曲线，可以绘制出INTF在 乙醇溶液中的标准曲线。

说明书

一种人工湿地污水处理系统微生物活性检测方法

技术领域

本发明涉及微生物活性检测方法，具体涉及污水处理系统微生物活性 检测方法。

背景技术

人工湿地污水处理系统的微生物新陈代谢活动，是维持人工湿地长效 净化作用的关键，在有机物降解和脱氮过程中微生物均发挥了重要作用。

微生物活性是表征人工湿地系统微生物新陈代谢作用强弱的重要指 标，该指标既可从分子生物学角度反映人工湿地污水 处理系统微生物去除 污染物的能力，又可从生物活性的高低衡量污染物的生物降解速度及评价 和预测人工湿地系统的运行效果。

在人工湿地污水处理系统的运行过程中，根据其中的微生物活性检测 结果，可对人工湿地处理系统运行状况进行监测，判断人工湿地微生物的 生物活性状态，然后利用自动或人工的方式调控运行参数，使湿地处理系 统保持在最佳的状态点运行，保证出水水质稳定达标。因此，研发快速、 灵敏、准确的人工湿地污水处理系统微生物活性检测方法，并利用该方法 来监控人工湿地污水处理系统的运行，对于提高人工湿地污水处理技术的 净化效能，保障人工湿地污水处理系统的优化运行控制，均具有十分重要 的意义。

对于人工湿地污水处理技术来说，可用于表征其系统内部微生物活性 的方法主要包括：

脱氧核糖核酸法(DNA，Deoxyribonucleic Acid)、活菌菌数法(ABN， Active Bacteria Number)、摄氧速率法(OUR，Oxygen Uptake Rate)、三磷酸腺 苷法(ATP，Adenosine Triphosphate)和电子传递体系(ETS，Electron Transport System)活性法等，这些指标或者是从微生物活细胞组分含量角度，或者是 从活细胞的新陈代谢速率角度反映微生物的生物活性，并表现出不同的分 析检测特性。

DNA是组成细胞的重要大分子之一，DNA含量能够准确指示人工湿地 系统中的活性生物量，但DNA法测定过程过于繁琐，且需要高尖端的仪器， 耗时较长，费用较高;ABN法是较灵敏的反映人工湿地中活性微生物量的 指标，但针对人工湿地中的混合菌种，ABN检测法的培养基选择和微生物 分离方法很难统一。

OUR法是用于测定好氧微生物活性的专性指标，不能用于人工湿地中 厌氧和反硝化脱氮微生物活性的测定;ATP法仅能反映系统内微生物的总 活性，并不能区分不同种群微生物的活性，测定方法的繁琐性和复杂性也 限制该技术的应用。

人工湿地微生物电子传递体系活性是通过测定呼吸链上电子的传递速 率来间接指示微生物的呼吸活性，进而定量微生物活性。该方法可同时检 测的样品数量不受限制，操作简便，适于现场应用，所需的仪器设备均是 实验室常规仪器，因此近年来颇受重视。

传统的微生物电子传递体系活性常采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC， 2，3，5-triphenyltetrazolium Chloride)为人工电子受体进行检测，TTC在微生 物电子传递体系作用下会接受电子而还原，生成红色的TF(Triphenyl Formazan)，并以晶体形式沉积在微生物细胞内。但TTC应用于人工湿地微 生物电子传递体系活性的检测存在如下问题：

1、TTC的氧化还原电位较高(+490mV)，对电子的亲和力小，与氧竞争 电子的能力弱，TTC的适用范围因此有一定限制，不适合检测人工湿地中 厌氧和反硝化脱氮微生物的生物活性;

2、TTC实验操作繁琐，需要除氧步骤，以避免氧对检测结果的干扰;

3、TTC实验一般以丙酮、甲苯和丙酮+四氯乙烯(2+3)作为萃取剂， 这些萃取剂对实验操作人员的身体健康均存在不同程度的危害作用，尤其 四氯乙烯还属可疑的致癌物质;

4、TTC实验的萃取过程常在高温(90℃)下完成，容易出现萃取剂蒸 发问题，实验结果的准确性受到很大影响;

5、TTC实验需要的培养时间较长，而且电子受体的变色现象不稳定， 灵敏性很难保证;

6、TTC实验常以单位体积样品在单位时间内所产生的TF数量为单位 表示，该活性单位不但无法真实表征单位干重微生物量所具有的电子传递 体系活性，而且在单位体积样品微生物含量不同的情况下，用该单位所表 示的生物活性很难进行横向比较。

上述问题说明，以TTC为电子受体的微生物电子传递体系活性检测方 法，在人工湿地污水处理系统微生物活性检测中的应用受到很大限制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工湿地微生物活性检测方法，解决现有 的人工湿地污水处理系统微生物电子传递体系活性检测方法存在的上述不 足，达到快速、准确、安全检测人工湿地微生物电子传递体系活性的目的。

本发明的方法，依次包括如下步骤：

(1)从人工湿地污水处理系统中取出附着微生物的植物根须或基质， 超声振荡5～10min，收集脱落的生物膜，用水稀释至浓度为5～6g/L，获 得微生物悬浊液;

(2)将Tris-HCl缓冲溶液和重量浓度为1.0～3.0mg/mL优选2mg/mL 的碘硝基四氮唑(简称INT，下同)溶液加入步骤(1)的微生物悬浊液， 然后置于35～37℃下，暗处振荡培养1～2h，获得培养物;

体积比为：

微生物悬浊液∶Tris-HCl缓冲溶液=1∶1.5～2;

微生物悬浊液∶INT=1∶1～2;

(3)向步骤(2)的体系中，加入1mL甲醛溶液，终止酶反应，然后， 过滤，收集滤饼;

甲醛溶液的体积浓度为35～37%，加入的体积比为：

步骤(2)的培养物∶甲醛溶液=1∶0.2～0.3;

(4)向滤饼中加入乙醇，搅拌，在35～37℃下，暗处振荡萃取5～10min， 然后过滤，收集萃取液，然后在分光光度计的485nm处，以加入0.1～0.2ml 间甲酚的样品为空白对照，测定待测样品的INTF萃取液吸光度;

(5)计算结果，采用式(1)计算人工湿地污水处理系统微生物电子 传递体系活件：

INT - ETSA = OD 485 × V K × t × W - - - ( 1 )

式中，INT-ETSA为微生物电子传递体系活性[mg/(g·h)];

OD485为波长485nm处的上清液吸光度;

V为萃取剂体积(mL);

K为标准曲线斜率;

t为培养时间(h);

W为微生物样品质量(g)。

标准曲线的制作方法如下：

1)准确称取0.050g INTF定容于50mL茶色容量瓶中，此溶液即为 1mg/mL的INTF标准溶液。

2)分别吸取1mg INTF/mL标准溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7， 0.8，0.9，1，2mL加于50mL茶色容量瓶中，再用乙醇分别稀释至50mL， 摇匀，于是得到每毫升含有0.002，0.004，0.006，0.008，0.010，0.012，0.014， 0.016，0.018，0.020，0.040mg INTF的系列溶液。

3)在721分光光度计的485nm处，用光程1cm的比色皿，以乙醇作 为空白溶液，测定上述11种浓度溶液的吸光度。

4)将上述11种浓度溶液与相应的吸光度作曲线，可以绘制出INTF在 乙醇溶液中的标准曲线。

本发明利用碘硝基四氮唑(INT，2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl) -5-phenyl Tetrazolium Chloride)作为人工电子受体检测人工湿地微生物电子 传递体系活性，该电子受体在微生物呼吸作用下会被还原为紫色的INTF (Iodonitrotetrazolium Formazan)。INT应用于人工湿地微生物活性检测具 有如下特点：

1、INT的氧化还原电位较低(+90mV)，对电子的亲和力大，与氧竞争 电子的能力强，实验可在有氧条件下进行，可用于检测好氧、厌氧及反硝 化脱氮微生物的生物活性;

2、INT接受电子能力强，变色明显、稳定;

3、INT实验可以用乙醇为萃取剂提取微生物细胞内的INTF，与丙酮、 甲苯和四氯乙烯等相比，乙醇有利于保证实验操作人员的身体健康;

4、INT实验的萃取过程可在常温(37℃)条件下进行，无需高温萃取， 避免了高温带来的萃取不完全、萃取剂蒸发等负面问题。

本发明以INT为人工电子受体检测人工湿地污水处理系统微生物的电 子传递体系活性，其积极效果体现在：

1、利用超声波剥离人工湿地植物根际和基质上的微生物量，实现微生 物的快速剥离和生物菌浊的均匀混合;

2、以INT为人工电子受体，利用INT的强电子亲和性，取消除氧过程， 简化操作步骤;

3、INT实验可用于检测好氧、厌氧及反硝化脱氮微生物的电子传递体 系活性;

4、培养时间从12h减小到2h，缩短分析检测时间;

5、以乙醇作为INT实验的萃取剂，与传统萃取剂相比，该萃取剂有利 于保证分析人员的身体健康;

6、将微生物干重直接测定法与微生物电子传递活性检测过程相结合， 避免了因基质和植物根际微生物数量不同和取样不均而产生的误差，实现 了单位干重人工湿地微生物电子传递体系活性的准确检测，提高了实验结 果的准确性和重现性，有助于人工湿地污水处理系统微生物电子传递体系 活性检测方法的标准化和规范化;

7、达到了人工湿地微生物电子传递体系活性的常温(37℃)检测目的， 避免了因高温带来的萃取不完全、萃取剂蒸发等负面问题;

8、操作简便，检测速度快且适于现场应用;

9、适用范围广，所有的人工湿地微生物活性均可测定;

10、检测结果重现性好，精度高。