考点1基因工程的工具与操作程序

1.(2019江苏单科,16,2分)下列生物技术操作对遗传物质的改造,不会遗传给子代的是 ()

A.将胰岛素基因表达质粒转入大肠杆菌,筛选获得基因工程菌

B.将花青素代谢基因导入植物体细胞,经组培获得花色变异植株

C.将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵,培育出产低乳糖牛乳的奶牛

D.将腺苷酸脱氨酶基因转入淋巴细胞后回输患者,进行基因治疗

答案D本题以基因工程为信息载体,考查考生运用所学知识,对某些生物学问题进行解释、

推理得出正确结论的能力;试题通过基因工程技术遗传性分析,体现了对科学思维素养中的分析

与判断要素的考查。胰岛素基因表达质粒导入大肠杆菌,获得的工程菌可将胰岛素基因遗传给子

代,A不符合题意;B、C培育的转基因植物和转基因动物的每个细胞均含有目有基因,后代可表现

转基因性状,B、C不符合题意;将转入目的基因的淋巴细胞回输患者体内后,患者的生殖细胞不含

目的基因,故子代不表现转基因性状,D符合题意。

2.(2020江苏单科,33,8分)如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列

两侧的序列,具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例):

请据图回答问题:

(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种酶,它通过识别特定的切割特定位

点。

(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成;PCR

循环中,升温到95℃是为了获得;TaqDNA聚合酶的作用是催化

。

(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是

(从引物①②③④中选择,填编号)。

(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核

苷酸序列),结果正确的是。

DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)

已知

序列

PCR

引物

①5'-AACTATGCGCTCATGA-3'

②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'

③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3'

④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'

A.5'-AACTATGCG…………AGCCCTT-3'

B.5'-AATTCCATG…………CTGAATT-3'

C.5'-GCAATGCGT…………TCGGGAA-3'

D.5'-TTGATACGC…………CGAGTAC-3'

答案(1)限制性核酸内切(或限制)核苷酸序列

(2)磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸(3)②④(4)B

解析(1)EcoRⅠ是一种限制性核酸内切酶,它通过识别特定的核苷酸序列切割特定位点,使切割

后的DNA片段带有相同的黏性末端。(2)DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间

形成磷酸二酯键。在PCR循环中,升温到95℃是为了使DNA变性,DNA双链解旋为DNA单链,以作

为DNA扩增的模板链。TaqDNA聚合酶以DNA单链为模板,以结合在特定DNA模板上的引物为

出发点,将4种游离的脱氧核苷酸按5'→3'方向沿模板链顺序合成新的DNA子链,故其作用是催化

以DNA为模板的DNA链的延伸。(3)片段F中,已知的DNA序列为

,要通过

设计引物进行反向PCR,从而得到已知序列在两端、未知序列在中间段的PCR产物(过程如反向

PCR的原理示意图),则需要反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,因此要选择5'-

GCAATGCGTAGCCTCT-3'和5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'这对引物。(4)据题图及反向PCR的

原理示意图可知片段F的两端为EcoRⅠ切割后的黏性末端,故正确选项为B。

3.(2019江苏单科,33,8分)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素

抗性基因(tet

)和氨苄青霉素抗性基因(amp

)。请回答下列问题:

图1

(1)EcoRⅤ酶切位点为 ,EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为末端。

(2)用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷

酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基

因片段在酶作用下,形成重组质粒P3。

(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌

落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是

(填表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是、。

…GATATC

…CTATAG





菌落类型平板类型ABC

无抗生素+++

氨苄青霉素++-

四环素+--

氨苄青霉素+四环素+--

(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图

2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是

。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段,原因是

。

图2

答案(1)平(2)胸腺嘧啶(T)DNA连接(3)BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒(4)

乙丙目的基因反向连接

解析(1)EcoRⅤ从识别序列的中心轴线处切割,所以产生的末端为平末端。(2)由于载体和目的

基因要连接成DNA分子,所以目的基因片段的两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸时,载体P1的

两端应各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸。在DNA连接酶的作用下,可将P2和目的基因连接,形成

重组质粒P3。(3)重组质粒P3上有完整的氨苄青霉素基因,所以含有重组质粒P3的菌落在无抗生

素和添加氨苄青霉素的培养基上能生长,而在添加四环素的培养基上不能生长,所以应选择的是B

类菌落。A类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素+四环素的培养基上均能生长,说明A

类菌落导入了P0。C类菌落在添加氨苄青霉素、四环素、氨苄青霉素+四环素的培养基上均不能

生长,说明C类菌落未导入质粒。(4)选择的一对引物组合、目的基因与重组质粒的连接方向及扩

增片段长度的可能情况如表:

由表可知,PCR鉴定时应选择的一对引物是乙丙。若扩增出了400bp片段,则原因是目的基因反向

连接。

引物组合扩增片段(bp)

连接方向

甲乙 乙丙 甲丙

正向 0 350 450

反向 400 0 450

知能拓展 PCR过程中,目的基因扩增n次,共产生2

个DNA,其中1个DNA上含引物Ⅰ,1个DNA上

含引物Ⅱ,2

-2个DNA既含引物Ⅰ,也含引物Ⅱ。该过程共需要2

-1个引物Ⅰ和2

-1个引物Ⅱ。

4.(2018江苏单科,32,8分)为生产具有特定性能的α-淀粉酶,研究人员从某种海洋细菌中克隆了α-淀

粉酶基因(1 656个碱基对),利用基因工程大量制备α-淀粉酶,实验流程见图。请回答下列问题:

(1)利用PCR技术扩增α-淀粉酶基因前,需先获得细菌的 。

(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,需在引物的 端加上限制性酶切位点,且常

在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点,主要目的是

。

(3)进行扩增时,反应的温度和时间需根据具体情况进行设定,下列选项中 的设定与引物有

关, 的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)

①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间

⑤退火时间 ⑥延伸时间

(4)如图表示筛选获得的工程菌中编码α-淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列:

5'-AUGCCAUCAACAAAUACUAACACUU……-3'

图中虚线框内mRNA片段包含 个密码子,如虚线框后的序列未知,预测虚线框后的第一个

密码子最多有 种。

(5)获得工程菌表达的α-淀粉酶后,为探究影响酶活性的因素,以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测

定酶活性,结果如下:

根据上述实验结果,初步判断该α-淀粉酶活性最高的条件为

。

缓冲

液

50 mmol/L Na2HPO4 -KH2PO4 50 mmol/L Tris-HCl 50 mmol/L Gly-NaOH

pH 6.0 6.5 7.0 7.5 7.5 8.0 8.5 9.0 9.0 9.5 10.0 10. 5

酶相

对活

性%

25.4 40.2 49.8 63.2 70.1 95.5 99.5 85.3 68.1 63.7 41.5 20.8

答案 (1)基因组DNA (2)5' 使DNA片段能定向插入表达载体,减少自连 (3)② ⑥ (4)8

13 (5)pH为8.5,缓冲液为50 mmol/L Tirs-HCl

解析 (1)由题干信息可知某种海洋细菌含有α-淀粉酶基因,因此在扩增α-淀粉酶基因前需先从细

菌中提取细菌的基因组DNA。(2)引物的作用是引导子链的延伸,将脱氧核苷酸连接到引物上时,

是与引物的3'端相连的,由此确定需在引物的5'端加上限制性酶切位点。常在两条引物上加入不

同的限制酶切位点的主要目的是使DNA片段能定向插入表达载体,防止自身相连。(3)进行PCR扩

增时,退火的温度与引物长短和碱基种类有关。延伸时间长短的设定与扩增片段的长度有关。(4)

密码子是指mRNA上决定一个氨基酸的三个相邻的碱基,该mRNA上5'端为AUG(起始密码子),因

此可依据三个碱基是一个密码子来分析图中虚线框中的碱基,可得出共有8个密码子。由于虚线

框后的第一个密码子的第一个碱基已经固定为U,因此还有2个碱基未知,共可能有的种数为4×4=1

6,又因为UAG、UGA、UAA为终止密码子,因此决定氨基酸的密码子最多有13种。(5)据表格数

据可知:α-淀粉酶在pH为8.5、缓冲液为50 mmol/L Tris-HCl的条件下相对活性为99.5%,初步判断

此条件下酶活性最高。

5.(2017江苏单科,33,8分)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白,某研究小组计划通过

多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因,构建转基因工程菌,用于重金属废水的净化处理。PCR

扩增过程示意图如下,请回答下列问题:

(1)从高表达MT的生物组织中提取mRNA,通过 获得 用于PCR扩增。

(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2),为方便构建重组质粒,在引物中

需要增加适当的 位点。设计引物时需要避免引物之间形成 ,

而造成引物自连。

(3)图中步骤1代表 ,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。

(4)PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏 的碱基配

对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关,长度相同但 的引物需要设定更

高的退火温度。

(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有 (填序号:①升高退火温

度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。

答案 (1)逆转录 cDNA (2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对 (3)变性 (4)引物与模板

G/C含量高 (5)②③

解析 (1)依据题中表述现象分析,mRNA合成目的基因的过程应为逆转录过程,由mRNA直接逆转

录形成的为cDNA。(2)构建重组质粒时需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶,因此推测在引物中

需要增加适当的限制性核酸内切酶识别的位点。设计引物时需要注意避免引物1和引物2之间形

成碱基互补配对。(3)题图中步骤1代表变性。(4)退火温度过高会破坏引物与模板链之间的碱基

互补配对。由于含G/C碱基对多的DNA稳定性强,因此在PCR过程中设置的温度应视G/C的含量

而定。(5)温度过高不利于引物与模板结合;引物设计不合理也会影响PCR扩增反应。

知识归纳 关于引物的几个问题:①引物是一小段DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基序列

互补配对,其长度通常为20~30个核苷酸。②由于PCR利用了DNA的热变性原理,因此温度的高低

直接影响DNA变性、复性和延伸的过程,特别是复性的过程也即题中的退火过程,它关乎引物是

否能与模板链结合,只有结合后才有可能进行“延伸”。③结合DNA结构特点,A与T之间有2个氢

键、C与G之间有3个氢键的知识分析,引物中含碱基不同耐温程度不同,其中含C/G较多的引物,

PCR扩增时温度可适当提高。

以下为教师用书专用(5-14)

6.(2014江苏单科,23,3分)下列关于基因工程技术的叙述,错误的是(多选) ( )

A.切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列

B.PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应

C.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因

D.抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达

答案 ABC 限制酶的识别序列多为6个核苷酸,也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸

组成,A错误;PCR反应中,起初的90~95 ℃高温是使目的基因解旋,后冷却至50 ℃左右是使引物结

合到互补DNA链上,最后再加热至72 ℃左右是让DNA聚合酶催化DNA的子链延伸,B错误;载体质

粒上的四环素抗性基因、青霉素抗性基因等抗生素抗性基因常作为标记基因,C错误;目的基因即

使成功地插入到受体细胞染色体上,如果不是在启动子和终止子之间,也不能正常表达,D正确。

7.(2013江苏单科,22,3分)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应,为

了克服这个缺陷,可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确

的是(多选) ( )

A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列

B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列

C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶

D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞

答案 BD 本题主要考查PCR技术的有关知识。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段

已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列设计引物,但不需知道目的基因的全部序列,需要

考虑载体的序列;因PCR反应在高温条件下进行,故反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶;因某

些目的基因编码的产物需经特殊的加工修饰过程,故一定要根据目的基因编码产物的特性选择合

适的受体细胞。

8.(2018北京理综,5,6分)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制性核酸内切酶分别处理同一DNA片段,酶切位点

及酶切产物分离结果如图。以下叙述不正确的是 ( )

图1 酶切位点图

图2 电泳结果示意图