【摘要】：随着生存环境的不断恶化,重大流行病毒爆发和癌症发病率的不断提高,给社会造成巨大的恐慌与经济损失。由于病毒侵染与癌症发病机制尚不清楚,相关药物开发相对滞后,迫切需要发展一种有效的病毒研究工具来揭示病毒侵染机制,并研究新型的肿瘤治疗手段,突破癌症治疗的瓶颈。近年来,基于代谢工程的生物正交靶向技术凭借其无损、高效、特异的靶向标记能力,已广泛应用于生物体的活体标记、示踪及肿瘤靶向性治疗等方面,并不断在拓宽纳米生物医学研究的应用领域。本文即以典型的囊膜病毒(假型流感病毒,H5N1p)与非囊膜病毒(肠道病毒,EV71)为研究对象,针对病毒侵染过程中的关键事件,通过细胞代谢工程与生物正交化学建立一种普适性的病毒体内原位标记技术,将其用于捕获病毒并追踪其体内的动态侵染行为。同时,本研究基于T细胞糖代谢工程与生物正交靶向技术,开发一种安全、高效的T细胞病毒转导技术,为临床CAR-T细胞的制备提供了新思路。主要研究内容包括以下三个方面:1.假型流感病毒H5N1p的叠氮化脂类代谢修饰与活体原位生物正交荧光标记。(1)利用细胞脂类代谢将叠氮-胆碱衍生物(AE-Cho)嵌合到细胞膜中,子代病毒出芽时囊膜表面即可携带叠氮(-N_3)基团。

叠氮修饰的假型流感病毒(N_3-H5N1p)通过生物正交反应与荧光探针形成稳定连接,从而实现病毒的原位标记。结果表明,92.5±4.1%的病毒能被荧光探针捕获,原位标记比常规直接预标记的病毒感染力高1.5倍,这说明病毒原位标记具有较高的标记效率,能有效保存病毒的侵染活性。(2)利用体内生正交反应对病毒进行原位标记,以监测病毒进入宿主靶组织的早期侵染事件。通过小鼠滴鼻感染模型,生物正交靶向荧光探针在肺部迅速捕捉到流感病毒,并在12-24 h内整个小鼠肺部的病毒荧光信号呈现出一个动态变化过程。结果证明病毒原位生物正交标记具有高效、无损的优点,并可成功用于体内、外病毒动态示踪研究。2.体内原位生物正交标记实时监测肠道病毒EV71在体内的侵染及动态组织迁移过程。(1)发展针对非囊膜病毒EV71的高效点击化学报告修饰体系。采用EDC/NHS交联将化学基团DBCO修饰至病毒表面(DBCO-EV71),通过生物正交反应将荧光探针连接至修饰病毒表面,进而在细胞水平实现对病毒示踪。(2)建立高效、无损、稳定的体内EV71病毒原位标记和动态示踪模型。将DBCO-EV71腹腔注射感染ICR乳鼠,建立小鼠感染模型,配对的荧光探针(N_3-Cy5.5)通过生物正交反应在体内对病毒进行原位标记。

结果表明,N_3-Cy5.5在体内成功捕获到EV71病毒,在各脏器中病毒拷贝数与其荧光强度呈正相关,且不影响病毒侵染活性。(3)活体荧光成像示踪不同毒力株EV71病毒在小鼠体内扩散与组织趋向。原位生物正交标记策略不仅在多个器官中有效捕获EV71病毒,且不干扰病毒扩散和组织趋向。该策略揭示不同毒力株EV71动态扩散和组织趋向,尤其是阐明SC-EV71病毒株神经系统并发症等临床症状的主要原因─神经与呼吸系统趋向,这为直观地可视化研究肠道病毒体内侵染机制提供可靠的技术手段。3.发展一种基于糖代谢修饰与生物正交靶向的PEI-DBCO/慢病毒转导T细胞体系。(1)根据EDC/NHS交联反应,本研究将环炔基(-DBCO)修饰至阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)上,成功制备PEI-DBCO聚合物,并与病毒颗粒形成PEI-DBCO/慢病毒纳米复合物。T细胞通过糖类代谢途径将Ac_4GlcNAz携带的叠氮基团(-N3)嵌入细胞膜中,PEI-DBCO/慢病毒纳米颗粒表面的-DBCO基团与T细胞膜表面的-N3通过高效、特异的生物正交反应,高效地将慢病毒靶向导入T细胞。(2)经PEI-DBCO/慢病毒转染系统改造后并不影响T细胞的增殖、活化及细胞表型,具有很好的生物安全性,并能促进抗肿瘤细胞因子IL-2、TNF-?与INF-?的表达,显著增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性。

此外,PEI-DBCO转导系统显著增强CAR-T细胞对体内Raji细胞的杀伤作用,改善荷瘤小鼠生存状态。该系统解决目前CAR-T细胞转染效率低,毒副作用大的难题,为深入改造、完善CAR-T细胞治疗提供新思路。综上所述,本研究利用基于细胞代谢工程的生物正交反应,成功实现体内病毒的捕获与动态追踪,以及安全、高效的CAR-T细胞制备,这为抗病毒药物的研制与临床CAR-T、TCR-T细胞治疗提供坚实的理论基础与可靠的技术支撑。