pd-1阻断剂增强nk细胞杀伤力的用途

技术领域

1.本发明属于细胞免疫治疗领域，具体涉及pd-1阻断剂增强nk细胞杀伤力的用途。

背景技术：

2.nk细胞又称自然杀伤细胞，是机体固有免疫的组成细胞之一，主要分布于外周血和脾脏。在正常情况下，nk细胞通过识别细胞表面的人类白细胞抗原(hla)ⅰ类分子区分“自我”与“非我”以杀伤或诱导凋亡来清除肿瘤细胞或病毒感染细胞。目前，nk细胞已被广泛用于肿瘤的过继免疫治疗中。由于nk细胞仅占外周血淋巴细胞的5％～15％，因而可以通过体外扩增以满足临床治疗的需求。实验研究已表明，体外扩增的nk细胞在肝癌、胶质母细胞瘤、白血病等多种肿瘤中均表现出良好的抗肿瘤效应。

3.pd-1是一种在激活的淋巴细胞上表达的抑制性受体，通过与肿瘤细胞表面表达的程序性细胞死亡配体1(pd-l1)结合，调节t细胞激活，介导肿瘤细胞的免疫逃逸。在对nk细胞的扩增过程中，pd-1阻断增强作用，对于患者的治疗具有积极的意义。

4.1,3-o-二咖啡酰奎宁酸在免疫细胞调节方面有一些研究报道，但是对nk细胞体外培养的影响以及作用机制未见研究和报道。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供pd-1阻断剂增强nk细胞杀伤力的用途。

6.本发明上述目的通过如下技术方案实现：

7.pd-1阻断剂用于nk细胞体外培养增强其杀伤力的用途。nk细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，nk细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放perforin、granzyme b到达靶细胞，perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导granzyme b进入靶细胞，granzyme b进入靶细胞后引发靶细胞的dna断裂使靶细胞凋亡。cd107a也是nk细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测perforin、granzyme b、cd107a的表达水平评价nk细胞的杀伤力强弱。据此可以说明，具体实施例通过阻断nk细胞中pd-1表达后有效提高了nk细胞的杀伤力。

8.优选地，所述pd-1阻断剂为1,3-o-二咖啡酰奎宁酸。具体实施例中，1,3-o-二咖啡酰奎宁酸有效阻断nk细胞中pd-1表达水平。

9.有益效果：

10.本发明发现，1,3-o-二咖啡酰奎宁酸用于nk细胞体外培养时可以有效增强其杀伤力，1,3-o-二咖啡酰奎宁酸发挥该作用的机制可能与阻断pd-1有关。

附图说明

11.图1是westernblot检测pd-1含量水平。

12.图2是流式法检测perforin、granzyme b、cd107a表达水平。

具体实施方式

13.一、实验材料

14.淋巴细胞分离液购自杭州联科生物技术股份有限公司，品牌为multisciences。il-2购自索莱宝，人ab血清购自上海联硕生物科技有限公司，nk细胞培养基品牌为cellgro。

15.1,3-o-二咖啡酰奎宁酸购自成都瑞芬思生物科技有限公司，hplc≥98％。

16.二、实验方法

17.1、nk细胞培养和鉴定

18.取适量抗凝外周血，加入淋巴细胞分离液，2000rpm离心20min，吸取白膜层，生理盐水洗涤3次，去上清，加入添加有200u/ml il-2和50ml/l人ab血清的nk细胞培养基(完全培养基)，调整细胞密度为1

×

106/ml，接种于6孔培养板中，于5％co2、37℃培养箱中培养，根据生长情况及时添加培养基。用percp-cy5.5标记的cd3、fitc标记的cd56与未诱导培养(0d)和培养12d的nk细胞孵育进行流式细胞术检测细胞表型。

19.2、分组和体外干预

20.取培养12d的nk细胞，接种于24孔板中，接种数量为1

×

105个，接种体积为1ml。分为对照组和干预组，每组3个复孔。适应性培养12h后，干预组更换为含有5μm 1,3-o-二咖啡酰奎宁酸的完全培养基继续培养，对照组更换为新鲜的完全培养基继续培养。继续培养48h后，收集细胞进行后续试验。

21.3、pd-1含量水平检测(western blot法)

22.收集继续培养48h的nk细胞，洗涤，ripa裂解液裂解，bca法测蛋白浓度。各组取等量总蛋白上样进行sds-page电泳，转膜、封闭后，加入pd-1、gapdh一抗，于4℃孵育过夜，次日加入相应的二抗，室温避光孵育120min，pbst洗去未结合的二抗，用化学发光显色后进行图像分析，采用image j软件对显影的条带进行灰度分析。

23.4、nk细胞杀伤活性检测(流式法)

24.收集继续培养48h的nk细胞，pbs洗涤并重悬调整细胞密度为1

×

107/ml，接种于流式管中，每管0.1ml，用pe标记的穿孔素(perforin)、pe标记的颗粒酶b(granzyme b)、apc标记的cd107a孵育进行流式细胞术检测。

25.5、统计学分析

26.使用graphpad prism 5软件进行数据统计学分析。数据采用均数

±

标准差表示，两组数据间比较采用配对t检验，以p＜0.05表示差异具有统计学意义。

27.三、实验结果

28.1、nk细胞培养和鉴定

29.流式细胞术检测结果显示，0d细胞cd3

－

cd56

阳性率为(10.8

±

3.7)％，培养12d的nk细胞cd3

－

cd56

阳性率高达(75.2

±

6.5)％，差异有统计学意义，nk细胞培养成功。

30.2、western blot检测pd-1含量水平

31.结果如图1所示，与对照组相比，干预组pd-1含量水平显著下调，差异有统计学意义，说明1,3-o-二咖啡酰奎宁酸阻断了pd-1的表达，1,3-o-二咖啡酰奎宁酸为nk细胞中pd-1表达阻断剂。

32.3、流式法检测perforin、granzyme b、cd107a表达水平

33.结果如表1和图2所示，与对照组相比，干预组perforin、granzyme b、cd107a的表达水平均显著上调，差异有统计学意义。

34.表1 perforin、granzyme b、cd107a表达水平

[0035] 对照组干预组perforin38.5％70.8％granzyme b34.6％62.5％cd107a72.1％88.7％

[0036]

nk细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，nk细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放perforin、granzyme b到达靶细胞，perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导granzyme b进入靶细胞，granzyme b进入靶细胞后引发靶细胞的dna断裂使靶细胞凋亡。cd107a也是nk细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测perforin、granzyme b、cd107a的表达水平评价nk细胞的杀伤力强弱。据此可以说明，本发明通过1,3-o-二咖啡酰奎宁酸阻断nk细胞中pd-1表达后有效提高了nk细胞的杀伤力。

技术特征：

1.pd-1阻断剂用于nk细胞体外培养增强其杀伤力的用途。2.根据权利要求1所述的用途，所述pd-1阻断剂为1,3-o-二咖啡酰奎宁酸。

技术总结

本发明公开了PD-1阻断剂增强NK细胞杀伤力的用途。NK细胞发挥杀伤靶细胞的过程中，NK细胞受到信号触发，先通过脱颗粒过程释放Perforin、GranzymeB到达靶细胞，Perforin作用是在靶细胞膜上穿孔通道进而介导GranzymeB进入靶细胞，GranzymeB进入靶细胞后引发靶细胞的DNA断裂使靶细胞凋亡。CD107a也是NK细胞脱颗粒过程中的重要参与因子。因此，本领域技术人员通常通过检测Perforin、GranzymeB、CD107a的表达水平评价NK细胞的杀伤力强弱。据此可以说明，本发明通过阻断NK细胞中PD-1表达后有效提高了NK细胞的杀伤力。提高了NK细胞的杀伤力。提高了NK细胞的杀伤力。

技术研发人员：于海涛

受保护的技术使用者：南京赛尔健生物技术有限公司

技术研发日：2021.09.30

技术公布日：2022/1/6