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研究内容简介

近日，Syntheticand Systems Biotechnology在线发表了刘天罡教授团队首次发现调控多杀菌素生物合成的调控因子的工作，论文标题为“The LysRfamily transcriptional regulator ORF-L16 regulates spinosad biosynthesis in Saccharopolysporaspinosa”（Volume 9,Issue 4, 2024, pp. 609-617）。

多杀菌素是由刺糖多孢菌经有氧发酵而产生的大环内酯类杀虫剂。其不但具有广谱的杀虫活性，而且对非靶标生物的毒性很低，故在农业、公共卫生、医药等领域具有广泛应用。多杀菌素生物合成基因簇在2000年已经确定，其生物合成途径目前也已被解析清楚。然而还没有调控多杀菌素生物合成的调控因子的报道。

基于此，考虑到调控因子可能与多杀菌素生物合成基因成簇排列，本研究对多杀菌素高产菌株WHU1123中多杀菌素合成基因的上下游基因进行BLAST分析，发现一个LysR家族调控因子ORF-L16。随后，本研究分析了多杀菌素基因簇含有6个转录单元和7个转录起始位点（图1）。

图1. 多杀菌素基因簇的转录单元与转录起始位点

通过Electrophoreticmobility shift assay（EMSA），本研究发现ORF-L16可以特异性的结合多杀菌素基因簇的7个启动子，表明ORF-L16可以调控多杀菌素的生物合成。此外，为了探究ORF-L16对多杀菌素的调控作用，本研究以多杀菌素高产菌株WHU1123为出发菌株，构建了敲除ORF-L16的菌株（∆ORF-L16）及利用ermEp*启动子过表达ORF-L16的菌株（OE-ORF-L16）。在∆ORF-L16菌株中，多杀菌素的产量大幅度降低（从1818.73 mg/L降低至1.69 mg/L），且多杀菌素基因簇转录水平下调，表明ORF-L16对多杀菌素的生物合成起正调控作用。然而，在过表达菌株中，多杀菌素的产量也降低了52%（图2）。过表达正调控因子使得次级代谢产物产量下降的现象也发生在阿维菌素的生物合成中。当利用低拷贝载体过表达正调控因子aveR时，阿维菌素的产量降低了约40%；利用高拷贝载体过表达aveR时，没有获得转化子（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2009; 82: 1089-96.）。推测正调控因子应该在合适的浓度范围内才能促进次级代谢产物的合成。

图2. 敲除及过表达ORF-L16对多杀菌素的影响

调控因子的效应物一般为调控途径的终产物或中间体，本研究利用分子对接模拟了ORF-L16与多杀菌素基因簇的终产物spinosyn A和两个典型的中间体aglycone和pseudoaglycone的结合情况。结果显示，spinosyn A和ORF-L16的结合亲和力最低，为-9.2kcal/mol，表明spinosyn A最有可能为ORF-L16的效应物。Isothermaltitration calorimetry（ITC）测定的Kd值（2.36 ± 0.04μM）也进一步证明了spinosyn A是ORF-L16的效应物。效应物结合后会影响调控因子与DNA的相互作用。在spinosyn A存在的条件下，ORF-L16与DNA的亲和力降低，即spinosyn A负反馈调节多杀菌素的生物合成（图3）。

图3. SpinosynA与ORF-L16的相互作用

武汉大学药学院博士生慕昕为本论文的第一作者，微生物代谢国家重点实验室、上海交通大学生命科学技术学院刘天罡教授和刘然副研究员为本论文的共同通讯作者。本项目得到了国家重点研发计划（2018YFA0900400）、国家自然科学基金（32100053）和中国科协青年人才托举工程（YESS20210068）的资助。刘天罡教授和刘然副研究员团队长期聚焦于多杀菌素合成及调控机理和产量提升研究并取得系列研究成果（Nat. Catal.,2024; J. Agr. Food Chem., 2024; Synth. Syst. Biotechnol., 2022; Synth. Syst.Biotechnol., 2021; Biotechnol. J., 2018; ACS Synth. Biol., 2017）。

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原文信息

The LysR family transcriptional regulator ORF-L16 regulates spinosad biosynthesis inSaccharopolyspora spinosa

Xin Mu, Ru Lei,Shuqing Yan,Zixin Deng, Ran Liu,Tiangang Liu