摘要：

抗生素耐药问题日益严重，未分离培养菌的研究对探索新抗菌药物的潜在来源十分重要。

前人对来自不同环境样本的短读长测序研究找到了宏基因组中次生代谢生物合成基因簇(BGC)多样性的证据，表明它们具有产生新型且有用化合物的潜力。而由于短读长测序的技术限制，从未培养菌中恢复全长BGC序列仍然是一个挑战，从而使BGC多样性的评估变得困难。

本文运用长读长测序证明了来自南极火星绿洲土壤中存在的未培养谱系的BGC的丰富多样性，还表明了长读长宏基因组测序作为一种有前途的方法，可以用于研究大多数未分离培养微生物的特殊代谢物基因簇的开发。

技术路线：

主要结果：

1. 样本地点和contigs、reads与BGC的系统发育分类展示

在门水平上展示MAGs、对包含BGC的contigs及三代reads分类。Binned-BGCS和contig级分类的交叉检查显示总共三个不同级别存在不同（门：0，纲：1，目：1，科：0，属：1，种：0）。其中，52个(1.7%)使用CAT方法在目级别结果不一致。这表明CAT错误分类的风险很低，但仍不能排除。在可用的情况下，首选bin结果进行物种分类。

2. 在非常规的特殊代谢物生产菌中发现不同的BGCs

三个著名的代谢物生产菌：放线菌、变形菌和拟杆菌，共同贡献了超过60%的BGCs。酸杆菌和疣状菌的BGCs占总数的20%。其中20%的NRPS（非核糖体肽合成酶）在门级别仍显示未分类，未发现古菌BGCs。

3. 酸杆菌的BGCs

按顺序对酸杆菌BGCs进行分析，结果表明萜烯的基因簇数量最多，PKS、NRPS、lassopeptide和细菌素簇也有显着贡献。Pyrinomonadales和Vicinamibacterales的占60%以上。

此外，发现了七个NRPS/PKS的巨合酶基因长度超过20Kb，其中最大的BGC是89Kb的NRPS和PKS巨合酶基因。最大的酸杆菌（Vicinamibacterales）BGCs-contig的大小为1.5Mb，包含三个BGC：一个PKS、一个萜烯和一个NRPS/PKS杂合簇。

4. 疣状菌的BGCs

按顺序对疣状菌BGC进行分析表明，绝大多数BGC是萜烯，其次是芳基多烯、PKS、NRPS 以及梯烷。最大的Verrucomicrobiota门分类中BGCs-contig大小为2.6Mb，具有五个BGC，其中两个是NRPS-PKS，巨合成酶基因大于20 Kb。

5. 放线菌的BGCs

放线菌门(335 BGC)具有大量未分类的BGC。按纲级别进行了分析，放线菌纲（114个BGC）包含富含BGC的属（如链霉菌属和假单胞菌属），在样品中贡献了大量的BGC。未归入较低分类等级的BGC数量表明，未培养的放线菌群存在大量未开发的BGC多样性。

值得注意的是，来自嗜热油菌纲的未培养目IMCC26256的一个环状基因组通过binning获得了单个大小为3.3 Mb的contig中，包含两个BGC。萜烯BGC (d = 1398)含有角鲨烯合酶、番茄红素环化酶和聚异戊二烯基合成酶，表明其在色素形成中起作用。CaiA相关的BGC (d = 1869)包含与CaiA相关的酰基辅酶A脱氢酶（参与糖类抗生素BGC）。

6. 变形菌的BGCs

对变形菌BGCs在目水平的分析表明，最大的贡献者是具有116个BGCs的伯克霍尔德氏菌目，其次是具有96个BGCs的UBA7966目。UBA7966包括多种BGCs，如萜烯、细菌素、膦酸酯、NRPS和NRPS杂化物、NRPS-like和芳基多烯。特别是，UBA7966中NRPS和膦酸盐BGC的高丰度与其他变形菌目的较低丰度形成差异。

DUF692是未知功能结构域（PF05114），对三个包含DUF692结构域的基因簇分析表明，FAM_02526（两个BGC）、FAM_02384（三个BGC）和FAM_02418（六个BGC）共同包含一个短的（大约240 bp）ORF、一个DUF692结构域、一个DUF2063结构域。

多序列比对结果表明，除了在朝向N端的40个氨基酸内有6个保守的半胱氨酸（一些紧接着是甘氨酸）和朝向C端的略微保守的疏水性补丁之外，其余序列显示出低程度的序列保守性。

7. 在其他未充分探索的门中发现的BGCs数量很少

发现来自Gemmatimonadales目分类的一个非常长（1.5 Mb）的contig包含两个BGCs：一个萜烯（d = 998）和一个NRPS/PKS BGC（d = 1423）。BGC1含有一种八氢番茄红素合酶和几种相关的氧化酶。BGC2包含六个PKS模块和两个NRPS模块以及以TonB受体存在的修饰酶表明该产物可以作为铁载体。

总结：

使用Nanopore宏基因组测序、分箱和基于contigs的分类方法能够从广泛的土壤细菌中鉴定出1417个BGCs，其中60%是完整的BGCs。这证实并进一步扩展了对难以培养的微生物的生物合成潜力的了解。此外，放线菌（嗜热菌和嗜热油菌）和变形菌（UBA7966）的未培养和未充分探索的谱系显示出巨大的生物合成潜力。

本研究进一步证明，ONT测序能够应用于高复杂环境。本文仅仅使用单样本进行72 Gb测序就可以获得大量完整的次生代谢产物基因簇，与使用短读取恢复大而完整的BGCs的研究相比，数据量减少了10倍。为使用合成生物学手段获得高效的次生代谢产物研究提供理论基础。

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