大家好，今天推送的文章来自于发表在Journal of agricultural and food chemistry上的“Reconstruction of a Cofactor Self-Sufficient Whole-Cell Biocatalyst System for Efficient Biosynthesis of Allitol from D‑Glucose”，通讯作者为广西大学轻工业与食品工程学院的Jidong Liu 。

蒜糖醇是一种典型的稀有糖醇,它也是一种重要的药物中间体和食品工业中潜在的低热量甜味剂,它可以降低血糖水平并促进肠道蠕动。然而，蒜糖醇的高成本限制了其大规模生产应用。与d-葡萄糖的自然提取和电解还原相比，基于微生物催化的生物合成路线通常被认为是一种更方便、更环保的生产蒜糖醇的方法。

微生物全细胞催化生物合成蒜醇的研究尚处于起步阶段。以前的大多数研究集中在挖掘单个模块和基本细胞工厂结构中酶的新来源。例如，已分离出的克雷伯菌，并构建了共表达核醇脱氢酶（RDH）和甲酸脱氢酶（FDH）的重组大肠杆菌，以高转化率但高生产成本从D-淀粉酶中生产蒜醇。在工程菌株中构建含有D-psicose 3-差异构酶（DPEase）、RDH和FDH的体内多酶级联催化系统（MECCS）也有助于从D-果糖或经葡萄糖异构酶（GI）预处理的D-葡萄糖生产蒜醇，以降低生产成本。然而，转化率仅为25.4%，远低于理论值，并且伴随着中间体的积累和低的全细胞催化性能。到目前为止，有关蒜醇合成中限速步骤的研究还很少报道，因此，有必要进行进一步的研究。

d-阿洛酮糖向大蒜醇的转化是一个消耗 NADH 的过程。此外，细胞内可用的 NAD(H) 含量预计是 NAD(H) 依赖性脱氢酶催化的还原 - 氧化反应的重要因素。先前有报道称，增加 NAD(H) 的供应可以以最大速率和滴度扩大代谢网络使能的产物合成的通量。例如，添加NAD +导致酶活性显着增加，导致l-亮氨酸的快速转化，表明大肠杆菌细胞内NAD +不足，导致目标产物的产量低.此外，不可忽视的是，过量的NAD(H)可能导致目标产物的收率降低，因此，通过调节辅因子的含量来提高合成效率仍然是一个具有挑战性的问题。

当人们认为多酶复合物的组装通常会导致比自由扩散更高的催化性能时，各种人工细胞内多酶组装策略，如蛋白质融合、RNA、DNA或蛋白质支架，以及无支架自组装，可以广泛应用。应用于生化反应网络。通过使用相互作用蛋白结构域及其配体组装关键酶，工程酵母的 dammarenediol-II 产量提高了 2.1 倍。然而，非共价自组装系统易受细胞生长环境因素的影响，如pH、金属离子和温度，导致酶活性和功能受损。相比之下，SpyTag/SpyCatcher 共轭对是多种酶在正常条件下通过快速和自发的共价交联的自组装策略。先前的一项研究证实，附着在目标酶的 N 端或 C 端的 SpyTag/SpyCatcher 可以通过共价键介导自组装并防止酶的错误折叠。因此，利用SpyTag和SpyCatcher片段的共价偶联组装模块，构建更稳定的多酶催化组装体系，对蒜糖醇的生产具有重要的现实意义。在上述发现的基础上，作者尝试提高体内NAD(H)利用率，构建多酶自组装系统，实现大肠杆菌中大蒜醇的高效合成。

作者首先通过将gi、dpe、rdh和fdh引入工程化大肠杆菌，构建了多酶催化途径和辅酶再生系统，以实现D-葡萄糖定向生产蒜醇。菌株 Ec/pR gd -pE fr产生高达 8.30 g/L 的蒜糖醇，生物催化活性相对较低为 2.58 U/g ， 9.16 g/L 的D-葡萄糖在催化 12 小时后以 0.52 g/g 的产率保持。此外，反应结束时积累了4.50 g/L D-果糖和2.17 g/L D-阿洛酮糖，这可能是由于下游酶系统的驱动力不足和中间产物的自由扩散所致。

随后作者研究了外源NAD（H）浓度对蒜醇生物合成的影响 ，当添加外部辅助因子时，菌株Ec/pRgd pEfr的催化活性增加，分别比添加0.32 g/L NAD+和1.00 g/L NADH的对照高117.7%和127.1%。催化12小时后，添加0.32 g/L NAD+的重组菌株Ec/pRgd pEfr达到最高值10.60 g/L蒜糖醇，为未添加NAD（H）的菌株的127.7%。此外，D-果糖和D-阿洛酮糖的积累量分别降至3.14和1.12 g/L。因此，很明显，辅助因子浓度是影响蒜糖醇制备效率的一个关键因素。

所后作者增加细胞内NAD（H）含量以促进蒜醇的生物合成。克隆来自枯草芽孢杆菌的gdh基因，并构建不同的工程大肠杆菌菌株。GDH的比酶活性为24.29 U/mg，比FDH高18.13倍。同时，菌株Ec/pR gd -pE gr的活性达到4.04 U/g，是菌株Ec/pR gd -pE fr的0.57倍。.在 12 小时反应后，使用菌株 Ec/pR gd -pE gr积累了 9.57 g/L 大蒜醇，产量为 0.56 g/g，转化率为 67.9% 。

一般来说，NAD +主要通过使用前体烟酸 (NA) 的补救途径合成。NAD(H) 合成途径中关键酶的过表达，加上 NAD(H) 前体供应的增加，被用来增强整个细胞内 NAD(H) 池。在这里，来自大肠杆菌BL21 的pncB和nadE在工程菌株 Ec/pR gd -pE gr -pC np中过表达，这导致生物量略有增加，促进了 21-pC np和 21-pR gd -pE gr -pC np中的 NAD(H) 浓度分别提高了 231.2% 和 120.3%。此外，NAD(H) 浓度随着 NA 浓度的增加而增加，并在添加 40 mg/L NA 时达到饱和。

在最佳催化条件下，菌株 Ec/pR gd -pE gr -pC np催化 12 h 后，以 0.63 g/g 的收率和 68.4% 的转化率产生高达 10.72 g/L 的蒜糖醇。同时，与菌株Ec/pR gd -pE fr相比，催化终点D-果糖滴度从4.50 g/L明显降低至2.20 g/L。

随后作者使用自组装肽标签 SpyTag 和 SpyCatcher 在重组大肠杆菌细胞中对生物合成途径酶进行空间组装，以提高蒜糖醇的产率和产量。

过构建质粒pRsd和32gsr，将末端功能化蛋白Spytag-DPEase（SD）和内部功能化蛋白GDH-SpyCatcher-RDH（GSR）连接起来，制备了三臂星形蛋白，将这两种质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中以构建菌株Ec/pRsd-32gsr。将gi插入pRsd的第一个克隆位点以产生质粒pRg-sd，将一个spRg-sd和32gsr转化到大肠杆菌BL21 pCnp中以产生菌株Ec/pRg-sd-32gsr-pCnp。具有自组装系统的菌株Ec/pRg-sd32gsr-pCnp的催化水平显著增加至7.66 U/g，比菌株Ec/pRgd-pEgr-pCnp高51.8%。此外，菌株Ec/pRg-sd-32gsr-pCnp在添加40 mg/L NA的条件下催化12 h，蒜糖醇产量达到15.03 g/L，产率为0.76 g/g，剩余D-葡萄糖进一步降低至5.15 g/L。

整理：张经纬

文章信息：

doi:10.1021/acs.jafc.2c00440

文章链接: