主要亮点

•单克隆抗体可以借助免疫系统中和人类病毒。

•由于单克隆抗体的高亲和力，可以被设计来对抗多种病毒靶标。

•抗体片段是抗病毒感染的下一代疗法。

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摘要

由于科学病毒学的广泛性，它已不再纯粹是微生物学的分支。病毒已然成为历史长河中重大流行病的致病因素。众多治疗策略被应用在这些微生物中，以这种方式，识别病毒的潜在靶标对于治愈成功至关重要。几十年来，抗体和抗体片段占据了针对传染病治疗方法的重要位置。由于它们的高亲和力，可以针对不同的目的进行设计，而这主要是由于诸如scFv，纳米抗体，双抗体和双特异性抗体之类的抗体片段可因其体积小和实用性浮现出来。在这篇综述中，我们讨论了作为针对病毒靶标的启发性治疗剂和诊断剂，抗体的发现以及抗体片段的分子和生物学设计。

1.引言

病毒是一个大的，有吸引力的，不同的微生物组群，其中的一些侵入人类身体会引起多种轻微甚至严重的疾病。人类病毒在整个历史上造成了严重和致命的疾病和流行病，在这些疾病和流行病中，人类感染病毒的历史源远流长。病毒仅在活细胞中生长，并且需要细胞上的特殊受体才能结合并进入细胞。为防治这些具有威胁的微生物和控制由它们引起的人类疾病，我们已经作出了许多和各种各样的努力。识别和确定病原病毒的潜在靶标是治疗疾病的重要一步。早期和准确的诊断定有助于控制疾病及其爆发，而这在很大程度上依赖于病毒靶标。

尽管使用了许多传统药物，但对于大多数病毒感染仍然没有明确有效的治疗方法。此外，新病毒的出现及其惊人的异质性表明，高效药物的发现和开发是预防病毒爆发和流行的迫切要求。

抗体是中和病毒的一种自然反应，它通过阻断病毒与细胞宿主之间的相互作用，或者在细胞宿主上代表病毒抗原，使效应细胞杀死被抗体包裹的靶细胞。这些细胞可以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或互补依赖性细胞毒性(CDC)等机制消除感染细胞。单克隆抗体(mAbs)因其独特的靶点特异性而成为治疗药物中的一个重要类别。它们在消除感染方面发挥了不容置疑的作用。单克隆抗体通过与游离病毒结合(病毒调理)或与细胞表面所需的受体结合使病毒附着并进入细胞，从而阻断病毒与宿主细胞之间的相互作用，从而中和病毒。它们还通过将被感染的靶细胞上的抗原(通过被感染细胞的调理作用)代表免疫系统效应细胞来帮助消除病毒感染。抗体通过片段抗原结合(Fab)与抗原结合，并通过片段可结晶(Fc)区域调节生物活性，例如与补体或Fc受体结合。Fcγ受体在效应细胞如吞噬细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞上表达。单克隆抗体将感染细胞呈递到效应细胞会导致ADCC、ADCP或激活细胞和体液细胞、CD8 T细胞、CD4 T细胞以及随后的B细胞激活。与补体成分结合也可能导致CDC裂解或产生调理病毒。这些病毒经补体调理后，以ADCP的方式被消灭。与游离病毒结合的抗病毒单克隆抗体也可以通过激活树突细胞、补体激活或ADCP来消除病毒。

很少有治疗病毒感染的单克隆抗体得到批准。Palivizumab和Ibalizumab是两种被批准用于治疗人类病毒感染的单克隆抗体。但是，更多的治疗性单克隆抗体正在临床阶段进行测试。已在印度进行的针对狂犬病G糖蛋白的II / III期临床试验中评估了基于抗体的产品RMAB（Rabishield），它是一种单一人类IgG1型单克隆抗体。该产品是为一个构象表位而开发的，可用作设计基于单克隆抗体产品时的学习过程。具有不同结合潜力的单克隆抗体的混合物也是一种抗感染的有效方法，它们也被开发用来对抗病毒靶标。ZMapp是Mapp Biopharmaceutical, Inc.开发的一种抗体混合物(cosfroviximab, larcaviximab, porgaviximab)，在II / III期临床试验中用来设计针对埃博拉病毒糖蛋白。

由于成功的靶向治疗和有效药物，近年来人们进行了许多尝试来减少其局限性。这些策略包括工程抗体，最小化策略和发展更小的重组抗体片段保持整个单克隆抗体的靶向特异性。虽然一些完整的单克隆抗体已获批准或正处于临床阶段，但使用抗体片段对抗病毒感染尚未获批准或进入临床。通过设计和发现方法，工程方法的机动和理想抗体衍生物的开发如单链可变片段(scFv)、片段抗原结合(Fab)、纳米体或变种，双抗体和双特异性抗体，可靠的基于抗体的生物制药工具正在开发以针对病毒的诊断和治疗应用。最近，研究小组正致力于从一只美洲驼身上分离和研制抗冠状病毒刺突的单结构域抗体(VHHs)。目前引发大流行的新型冠状病毒被命名为COVID-19，它有一种名为刺突的大包膜蛋白，可以与宿主细胞相互作用。用此易感靶点免疫美洲驼，分离出VHHs。这种以vhh为基础的技术正被用于COVID-19感染的快速检测和治疗。

因为已经有一些关于抗病毒单克隆抗体的综述文章，所以这篇综述提供了单克隆抗体治疗和诊断病毒感染潜力的最新进展。也介绍了近年来抗体的发现和设计进展，并着重介绍了抗体衍生物和抗体片段，重点讨论了基于抗体片段的可靠抗病毒生物制药。

2.病毒靶标

单克隆抗体(作为一种高特异性的试剂)，可用于有效的靶向病原体，而不干扰正常的微生物群。病原体特异性抗体干扰致病蛋白和特定宿主表面受体(或共受体)之间的相互作用已在研究和临床中显示成功。由于独特的特性，有许多不同的病毒抗原可以作为抗体的潜在靶标。表1总结了所研究的最重要的病毒靶标。

表1.抗体的一些病毒靶标治疗应用

诊断应用

3.计算机模拟抗体设计

抗体是生物疗法中最大的一类，其中五种单克隆抗体药物跻身于十大畅销药物之列。然而，由于其复杂性、体积大、与患者免疫系统的相互作用以及药代动力学的不完善等问题，使其在临床上的应用面临一些障碍。因此缩小大小，以便于选择和操纵成为了生产抗体的主要目的。而通过体外和体内诱变的方法已获得了改善抗体亲和力和稳定性的效果。抗体工程的目的是通过定点诱变和随机诱变等技术生产出理想的抗体。基于基因不准确扩增的随机突变方法，具有简单、多功能性、快速和廉价等优点，已成为最常用的文库生成方法。随机诱变和筛选突变文库是该方法的组成部分。从抗体文库中选择具有不同特异性和亲和力的重组抗体和抗体片段和噬菌体展示，具有重要的价值。

噬菌体展示是一种有效的分子技术，通过该技术可以将目标肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合并将其展示给外部环境。它是研究蛋白相互作用，如是针对任何抗原的抗体并选择对特定靶标有高亲和力的蛋白的可靠来源。还有其他的显示技术，如核糖体显示和mRNA显示，分别基于核糖体自身与被显示蛋白之间的连接和蛋白通过嘌呤霉素与核酸标签的物理连接。它们全都用于蛋白质的进化，以产生具有所需特性的最佳配体以结合靶标。而且，由于体外方法和高通量性质，选择结合的条件受到严格控制，因此它们是通过工程抗体产生具有增强特性的抗体或抗体片段的极佳技术平台。

人免疫球蛋白G1是CDC和ADCC功能中最有效的抗体，因此具有广泛的应用价值。这是对病原体或肿瘤细胞最合适的治疗方法。另一方面，人免疫球蛋白G4在这两种功能上不活跃，可用于成像或阻断颅内分子。Fc区域也与抗体的血清半衰期相关，可以根据其应用对其进行改造，以减少或增加抗体的半衰期。此外，在人源化抗体中，只有CDR环(来自原始抗体的六个环;三个重链变量和三个轻链变量)负责检测和结合抗原与第二个人类变量连接，称为“移植CDR”。为了恢复老鼠单克隆抗体的初始亲和力，重要的氨基酸框架也被移植到人体抗体中，从而维持了老鼠抗体中CDR环的一致。自第一个人体抗体Zenapax于1997年进入市场以来，其他7个人源化抗体也已投放到治疗中。

抗体工程是增加与抗原结合趋势的非常活跃的领域。无论抗体是由杂交瘤，噬菌体文库还是其他技术制成，抗体都需要改善其对特定抗原的亲和力。亲和力不仅在物理上很重要，而且增加抗体的亲和力也可以提高其生物学活性并改善治疗效果。它还会减少抗体疗法的剂量，从而降低毒性。

应用单克隆抗体对抗冠状病毒S蛋白是提高抗体工程和亲和力的一个例子。几种单克隆抗体已经被用于对抗SARS-CoV，包括CR3014、m396、CR3022和最近出现的m336单克隆抗体，它是一种人类mers-cov特异性单克隆抗体。S蛋白（193个氨基酸：N318-V510）的受体结合域（RBD）被视为中和抗体的主要靶标。RBD上的不同表位可以被多种抗体识别；例如，CR3022和CR3014中和抗体与RBD非竞争性相互作用，协同中和病毒进入靶细胞。一些最有效的SARS-CoV特异性中和抗体(如CR3014和m396)对SARS-CoV-2没有显示中和作用。另一方面，CR3022可以作为候选，与其他中和抗体联用或单独使用对抗SARS-CoV-2。Prabakaran等人指出m396抗体与ACE2抗原的重链(33T、31S、58A、52T、97A)和轻链(96Y)上的几个残基相互作用。另外，H1区域的Thr33和Ser31位点，H2区域的Thr52和Asn58位点，H3区域的Val97位点也是与ACE2抗原相互作用的位点。鉴于这些特性，优化m396特性以增强其对ACE2蛋白的亲和力可能是有益的。因此，设想在该抗体序列中引入新的突变可以导致针对SARS-CoV-2对ACE2的亲和力成熟。

4.重组抗体片段的诊断潜力

单克隆抗体因其高亲和力和特异性而逐渐被公认是诊断不同人类感染的方法。随着DNA重组技术的应用和抗体产生方法的发展，在骆驼、软骨鱼和七鳃鳗中发现了大量的重组抗体，如Fabs、scFvs、diabodies和单域抗体(sdAbs)，如VHHs、鲨鱼可变新抗原受体(VNARs)和可变淋巴细胞受体(VLRs)，这些重组抗体具有惊人的有机活性。这些片段是单独开发的。它们不仅具有整个单克隆抗体的特异性，而且更容易在原核表达系统中表达。这些改变了医学科学的研究工具被广泛用于各种病原体检测的诊断分析。它们在诊断有害人类病毒方面显示出良好的结果。

VNAR是在鲨鱼中观察到的一种新的基于免疫球蛋白的蛋白质，是诊断应用的一个例子。与传统单克隆抗体不同的是，VNARs具有体积小、热稳定性高、旁链结构异常等优点，这引起了研究人员的极大关注。Feng, M.等人开发了一种文库生成方法来构建VNAR抗体文库。他们的方法是基于聚合酶链反应(PCR)延伸和自连接(命名为“EASeL”)来组装大量的VNAR抗体库。他们发现了与病毒抗原的结合物，其中包含中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)的刺突蛋白。分离出的鲨鱼单结构域抗体已在大肠杆菌中产生，并已证实可与其抗原结合。II型VNAR（PE38-B6）对它的抗原表现出高亲和力（Kd = 10.1nM）。

其他抗体衍生物被认为是成功检测病毒的潜在候选者。Doerflinger SY等人建立了一种基于纳米体的快速侧流免疫分析法(纳米免疫层析[Nano-IC])，用于检测临床标本中的人类诺如病毒。纳米IC技术对爆发标本的敏感性和特异性分别为80%和86%。然而，需要对纳米集成电路技术进行额外的调整来提高这种灵敏度，这也可以通过在器件中添加不同的具有广泛反应性的纳米体来实现。在另一项研究中，Liu JL等人制作了埃博拉病毒包膜糖蛋白(GP)的单一结构域片段抗体，并增强了其稳定性，以扩大其在严峻局部环境中的使用效率。他们用灭活的埃博拉病毒和GP重组蛋白对美洲驼进行免疫，建立了含有107个特异性克隆的免疫噬菌体文库。分离出了三种裂解常数在~2 ~至20 nM之间、熔点在57至 72°C之间的GP粘合剂。他们认为，未来的努力可以阐明这些分离的单一结构域抗体有作为埃博拉诊断或治疗目的候选抗体的潜力。Zhu M.等人提出了一种酶联免疫吸附测定法，该方法基于从被灭活半纯化的A/Texas/1/1977 H3N2病毒免疫的骆驼身上提取两个纳米体。这些纳米体具有识别H3N2病毒血凝素的独特能力。在酶联免疫吸附测定法中，其中一种纳米抗体用于与磁珠结合，另一个与报告酶结合，可检测到半纯化的H3N2病毒，最低浓度为50ng/mL。在一项研究中，我们选择了针对GB病毒C(GBV-C)非结构蛋白的特异性有用的scFv抗体。在大肠杆菌中表达了GBV-C非结构蛋白，构建了一个scFv源文库。这些重组scFv抗体可能成为进一步研究GBV-C的宝贵工具，有助于快速、准确地鉴定GBV-C感染的检测。

与全长抗体相比，抗体片段在埃博拉病毒诊断应用中可能是一种有用，实际且低成本的选择。Rodriguez-Martinez LM等人在大肠杆菌培养物中表达了三个重组抗GP scfv片段。这些scFvs包含了三种已被充分研究的抗gp全长单克隆抗体的轻重可变部分。三种scfv在ELISA实验中均显示出与全尺寸抗GP抗体相似的独特抗GP结合活性。对含有适当EBOV颗粒的样本和埃博拉患者的样本进行研究，以完全验证这些scFvs诊断的有效性是必要的。

ScFv抗体也被用来开发使用噬菌体展示技术针对ZIKV包膜蛋白的治疗。在本研究中，经过生物筛选，4个scFvs与ZIKV E蛋白表现出了特异性的结合亲和力，可用于ZIKV的诊断或治疗。在另一项研究中，Matsunaga S等人设计了一种新的synNotch受体，包括抗HBsAg(乙型肝炎抗原)的scFv，并与细胞内合成转录因子相连接，将其建议用于病毒传感和细胞免疫治疗。设计的系统可感测HBV颗粒和膜结合的HBs抗原，并对报告分子secNL或GFP产生反应。在另一项研究中，Berrin Erdaga KBB等人。通过DNA重组技术设计了一种新型抗HBsAg /碱性磷酸酶双功能scFv，用于检测HBsAg。他们建议，他们的HBsAg scFvs可以在进一步的优化研究后用于简易酶联免疫吸附测定法。

双特异性抗体设计用于结合两个靶标，并被显著用于不同的医疗领域，也可以作为一种有吸引力的诊断工具，检测病毒靶标。Chen YP等人设计了一种针对人红细胞（RBC）和乙型肝炎病毒抗原（HBsAg）的双特异性双抗体，以检测血液样本中的HBsAg。在酶联免疫吸附测定法中，这种双特异性抗体显示出与每种RBC和HBsAg的精确结合。作为参考，与传统免疫分析法的结果进行比较时，该双抗体介导的凝集测定法具有97.7%的敏感性和100%的特异性。

5.抗体片段可作为抗病毒感染的疗法

虽然单克隆抗体目前是生物制药的有效性类别之一，但它们在病毒治疗中的应用还没有广泛普及。在没有病毒疫苗的情况下，在过去几年中，已开发出针对各种病毒如H5N1流感病毒，人类免疫缺陷病毒（HIV），单纯疱疹病毒（HSV），巨细胞病毒（CMV），丙型肝炎病毒（HCV），埃博拉病毒，马尔堡病毒， SARS病毒，登革热病毒，狂犬病毒，亨德拉病毒，尼帕病毒，黄热病病毒和西尼罗河病毒的中和单抗体病毒，证明了单克隆抗体对病毒感染的功效。

Palivizumab (Synagis)和Ibalizumab (Trogarzo)分别是两种已获批准的针对呼吸道合胞病毒(RSV)和人类免疫缺陷病毒的单克隆抗体。表2显示了针对靶病毒的主要治疗性单克隆抗体。

表2. 抗人类病原病毒的主要治疗性单克隆抗体

人类病毒会产生有效的中和抗体反应，这可能是抑制病毒感染的有效方法。目前，由于整个单克隆抗体存在体积大、生产成本高、产量低、错配和生产复杂等问题，抗体片段被认为是下一代单克隆抗体。病毒表位的可获得性是开发抗病毒单克隆抗体的一个瓶颈。scFv，Fab，单结构域抗体（sdAb）如骆驼科动物VHH在治疗病毒感染的抗体工程中更有应用价值。噬菌体展示技术是一种分离scFv、VHH等抗体片段或其它结合寡肽的稳健技术。因此，为了更好更成功的治疗，从受感染的患者或计算机模拟亲和力成熟中构建文库有助于获得高亲和力的抗体。

ALX-0171是一种结合RSV F蛋白抗原位点II的三聚体结构域纳米体药物。在检测率下，ALX-0171完全抑制了复制。ALX-0171在去除鼻和肺病毒滴度方面的作用比人源化单克隆抗体palivizumab更有效。针对人类免疫缺陷病毒1 (HIV-1)、流感病毒、丙型肝炎病毒(HCV)的基于VHH的药物正在开发中。

抗甲型流感病毒核蛋白（NP）的VHH与NP体域上的非保守区域结合，保护细胞免受病毒感染。该VHH的抗病毒活性是通过阻断病毒核糖核酸蛋白的核进入以及病毒基因组在细胞核中的转录和复制来显示的。

除VHH外，构建抗猪流行性腹泻病毒(冠状病毒家族)刺突蛋白的scFv，可对仔猪的病毒感染提供保护。Phoolcharoen等人使用了一种对狂犬病具有中和作用的scFv，该scFv与RVG(一种29个氨基酸肽)产生化学结合，专门用于尼古丁乙酰胆碱受体(nAchR)在中枢神经系统的结合。与scFv相比，该分子进入神经元细胞的效率更高，这表明它是一种对抗脑部狂犬病的新工具。针对表达马尔堡病毒糖蛋白(GP)的病毒复制子颗粒的免疫噬菌体展示文库获得的ScFvs在受到野生型马尔堡病毒攻击的小鼠中显示了75%至100%的保护效果。

片段结构域修饰的抗体是通过在高度有效的人类免疫病毒特异性3BNC117和10-1074 bNAbs(广泛中和抗体)的结构域插入两个替代突变来开发的，以增强半衰期和阻断感染类人猿-艾滋病病毒的效果。在其他研究中，表达了针对临床测试的HIV bNAb的scFv，这些scFv靶向四个区域，即V2-顶点，V3-聚糖超位，CD4结合位点和MPER（HIV-1 Env gp41亚基的膜近端外部区域）。与IgG相比，scFs的功能损失是可变的，但所有scFs均显示出良好的中和活性，表明抗体片段适合被动免疫以预防人类免疫病毒-1感染。

6.针对细胞靶标的抗体设计(靶向宿主治疗病毒性疾病)

虽然抗病毒药物的设计目标是病毒蛋白，并也已成功研制用于治疗病毒感染，但由于病毒的耐药性，作用范围狭窄，需要立即替代的特点，迫使制药行业的领导者们寻找新的药物靶标。近来，在中和或修饰细胞或分子靶标的基础上，已经开发出多种方法来诊断，治疗和预防病毒性疾病。由于靶向药物根据其特异性与靶标相互作用，因此抗体和重组蛋白是最佳选择。在过去的十年中，已经引入了新一代针对病毒性疾病的有效单克隆抗体。技术的进步和科学家们对生产将不同靶标组合在一起的新药的强烈期望导致了在特定疾病（例如病毒感染）的治疗策略中涉及两个靶标的双特异性抗体的开发。从两类双特异性抗体中，一种可以连接两个靶细胞的抗体被认为比其他抗体更能治疗病毒性疾病。

为了预防丙型肝炎病毒感染(HCV)， Meuleman等人研制了一种靶向清道夫受体B型I (SR-BI)的IgG4单克隆抗体，命名为mAb16-71。该单克隆抗体可有效预防Huh7.5细胞系和HCV原代肝细胞的感染。它能抑制病毒在细胞间的传播。通过治疗对在病毒接种前1天和3天后的uPA-SCID小鼠，其评估了mAb16-71的功效。结果显示，在接种前一天，所有嵌合体老鼠均受到保护，可抵抗不同类型的HCV基因型，接种后3天病毒载量降低。他们发现，以HCV共受体SR-BI为靶标的单克隆抗体可以防止肝内病毒感染和不同基因型的传播。

Zhang等人使用基于crispr - cas9的全基因组筛选来鉴定多种新出现的人工合成甲型病毒的受体，包括基孔肯亚病毒、罗斯河病毒、Mayaro病毒和O'nyong nyong病毒。他们引入细胞粘附分子Mxra8(基质重构相关8)作为病毒进入的介质。在他们的实验过程中，人们认识到anti-Mxra8单克隆抗体可以阻止基孔肯雅病毒在不同类型的细胞中感染，包括原发性人类滑膜成纤维细胞，成骨细胞，软骨细胞和骨骼肌细胞。他们认为这个单克隆抗体是一个药物靶标。

2F4的Fab是一种抗麻疹病毒的小鼠单克隆抗体，它通过两种细胞受体- SLAM和Nectin4抑制病毒的进入，其亲和力范围为纳米级。除了2F4 Fab外，scFv还通过阻断受体结合来阻止病毒颗粒的进入。

双特异性抗体被证明可以保护人类甚至动物模型免受艾滋病毒感染。Khan等人设计了可以同时靶向艾滋病毒主要共同受体CCR5和Env的分子。这些分子中和了109种病毒的98％至100％。它被设计为串联单链可变片段（scFvs）（10E8fv-N6fv和m36.4-PRO 140fv），显示50％抑制浓度（IC50s）的中位数为0.0685和0.0131。还设计了含有10E8-PGT121-PGDM1400 env特异性结合位点的三特异性抗体。它具有与前者相同的潜力（中位IC50为0.0135 g / ml），而三特异性分子10E8Fab-PGDM1400fv-PRO 140fv可以同时靶向Env和CCR5，具有更高的效能。他们还构建了一个包含恢复Fc受体结合能力的重构CH2-CH3结构域的三特异原型。所有三种设计的抗体均已证明是预防和治疗艾滋病毒的有效工具。为了克服抗病毒的局限性，Song等人利用抗gp120 bNAbs的单链可变片段与ibalizumab (iMab)融合，构建了双特异性抗体(biAbs)，ibalizumab是一种结合人类CD4 (HIV-1的主要受体)的人源化单克隆抗体。结果显示呼吸100%得到改善。

在感染SARS，MERS和新发现的名为SARS-CoV-2的严重患者中，冠状病毒可引起不同程度的细胞因子释放综合征（CRS）。在中国SARS-CoV-2期间进行的一项小型临床试验表明，tocilizumab对阻断炎症蛋白IL-6信号转导途径具有良好的作用，在CRS中发挥重要作用。在相关研究中， Xiaoling等人介绍，tocilizumab是挽救SARS-CoV-2患者的有效药物，可使患者体温恢复正常，改善呼吸功能。在案例研究中，Michot等人确认了患有COVID-19相关性呼吸衰竭的患者可以用这种药物治疗。目前，tocilizumab(品牌名Actemra)正在进行III期临床试验，用于治疗成年COVID-19重症患者。

7.未来前景

尽管市场上有许多治疗性单克隆抗体用于治疗不同类型的疾病，然而，很少有治疗性单克隆抗体被批准成为为抗病毒药物。这可能是由于各种原因造成的，但是一些挑战可以通过最小化和改造抗体来解决。到目前为止，还没有基于抗体片段的抗病毒生物药物，但是目前许多努力都集中在这些类型的病毒感染治疗药物上，预计这些产品将在不久的将来进入临床阶段，甚至进入市场并成为抵抗传染病尤其是病毒靶标的重要治疗剂。

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