克隆是英文“clone”或“cloning”的音译，而英文“clone”则起源于希腊文“Klone”，原意是指以幼苗或嫩枝插条。1963年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆（Clone）”的术语，把“克隆技术”带到了人们的视野中。

克隆技术又称为“生物放大技术”，目前应用最广泛的技术为“分子克隆”，又称重组DNA技术，即通过重组技术将目的DNA片段按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生新的遗传性状的技术。

随着分子生物学研究的不断深入，分子克隆技术也随之更新迭代，从传统的依赖限制性内切酶的方法发展到如今的TA克隆、TOPO克隆、无缝克隆、Gateway技术等等，新的技术不断涌现，为分子生物学的发展和进化提供新的力量。今天小翌就带领大家认识一下不同的分子克隆方法。

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传统分子克隆技术

传统分子克隆技术的依赖于限制性内切酶和酶切位点。主要步骤是通过限制性内切酶（）酶切载体和目的基因，通过连接酶（）将酶切的片段拼接在一起（即连接过程），形成可以表达目的基因的新载体（即重组质粒），使用转化技术转化至感受态细胞中，进而实现目的基因的扩增、转录和翻译。

传统分子克隆实验流程如下图：

图1.传统分子克隆实验流程

该技术最早由Cohen Group在1973年实现，他们将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割，连接成新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer，实现了细菌遗传性状的转移。传统分子克隆技术较为成熟，但是该方法受到限制性酶切位点和连接效率等方面的限制，并不能高效、准确的克隆需要的目的基因。

图2.Stanley Cohen和Herbert Boyer（第一个成功实现基因工程技术的团队）

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TA克隆

TA克隆（Original TA Cloning Kit），依赖于PCR反应中所使用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在克隆片段的3’末端加上A尾（即3’-A），通过连接酶（）把克隆片段与一个具有3’-T突出的载体DNA连接起来。主要应用于不清楚目的基因DNA序列的实验，通过TA克隆重组到T-载体后，使用T-载体的上下游引物扩增片段，测序，最终确定目的基因序列。其中，聚合酶的选择尤为重要，翌圣普通PCR试剂盒（Cat#10102/10103/10157）、均具有Taq DNA聚合酶，扩增后的PCR产物具有3’-dA突出端，可轻松克隆至T载体。

图3. TA克隆流程示意图【3】

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TOPO克隆

TOPO克隆技术是通过TOPO载体上偶联的异构酶(Topoisomerase)实现插入片段的快速克隆。其原理是利用Topo载体两端通过磷酸键偶联的Topo酶，在连接反应中，受插入片段的5'端羟基的攻击，磷酸键释放能量。利用该能量，插入片段5'端羟基与载体片段3'端磷酸基团连接在一起，Topo异构酶从载体分子上脱落，完成连接反应。不同于传统的TA克隆，TOPO克隆能够在2-5 min内快速完成插入片段和载体的连接反应，操作简单，连接效率极高。

图4. TOPO克隆原理

目前市面上的产品，需根据DNA片段末端的不同，选择不同的TOPO克隆试剂盒。而，能够兼容平末端产物或粘性末端产物，不受片段末端影响，快速克隆连接，效率高，阳性率接近100%，如图5所示。

图5.TOPO TA/Blunt克隆试剂盒轻松连接2 kb（10 ng）平末端/粘性末端片段

注：A&B：TOPO克隆转化平板。C&D：插入片段PCR鉴定电泳图。

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无缝克隆技术

传统克隆和TA克隆两种方法费时费力，过程繁冗，为了解决限制性酶切位点的限制，科学家们研发出新的、快速、简洁、高效的克隆技术——无缝克隆，区别于传统分子克隆，唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上15-20个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，不经过酶切，PCR产物和线性化载体在同源重组酶的作用下，经过一定的时间和温度即可进行转化，完成定向克隆。

图6.同源重组原理

无缝克隆技术最早是2009年由Daniel Gibson和J. Craig Venter发展起来，广泛应用的方法包括两种Gibson Assembly和In-Fusion Cloning，原理都是通过外切酶产生黏性末端，再通过同源重组酶的连接得到重组片段，但是两种方法的外切酶完全不同，形成重组序列的方式也不一样。

Gibson Assembly：包含T5 exonuclease、Phusion DNA polymerase和Taq DNA Ligase三种酶，通过5’→3’ T5核酸外切酶活性，沿着5’→3’方向降解dsDNA，产生3’黏性末端，通过同源臂互补配对，退火后借助Phusion DNA聚合酶修复片段上的缺口，Taq DNA连接酶催化片段形成磷酸二酯键，将所有缺口补齐，获得重组片段。

图7. Gibson Assembly原理图【5】

In-Fusion Cloning：具有3’→5’ 核酸外切酶，能够识别3’末端碱基，沿着3’→5’ 方向降解dsDNA，产生5’黏性末端，同源臂互补，退火后配对，因为其不含连接酶，所以要将重组片段转化到感受态细胞内，序列中的缺口会在感受态体内补平、连接，获得重组片段。

图8. In-Fusion Cloning原理【6】

翌圣同源重组试剂盒利用无缝克隆技术，仅需50℃反应20 min即可转化，完成定向克隆，克隆阳性率可达95%以上。其中，可连接单片段，该试剂盒已发文章累计IF达到1000+。可连接1-6片段，最长连接片段可达23 kb，是多片段连接的不二之选。

通过上述的介绍，相信大家已经初步了解了目前实验室中常用的分子克隆技术，那么还有哪些新开发的分子克隆技术呢？无缝克隆中不常见、特殊的分子克隆技术又有哪些呢？关注我们，小翌会在下一期的分子克隆技术专题中，给大家介绍新的分子克隆技术，为您的实验带来新的思路与方向，期待下一次的见面~

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相关产品列表

产品定位

产品名称

产品货号

规格

通用缓冲液，5min完成精准酶切

FuniCut™快速限制性内切酶

15001ES-15051ES

50 T

常规PCR

2×Hieff®PCR Master Mix(With Dye)

10102ES03/08

1 mL/5×1 mL

常规PCR，不含染料

2×Hieff®PCR Master Mix(No Dye)

10103ES03/08

1 mL/5×1 mL

快速PCR，快至1s/kb

2×Hieff®Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix(with Dye)

10157ES03/08

1 mL/5×1 mL

TOPO克隆-兼容TA/平末端

Hieff Clone®Universal Zero TOPO TA/Blunt Cloning Kit

10906ES20

20 T

TOPO克隆-TA末端

Hieff Clone®Zero TOPO-TA Cloning Kit 零背景TOPO-TA克隆试剂盒

10907ES20

20 T

TOPO克隆-平末端

Hieff Clone®Zero TOPO-Blunt Cloning Kit

10909ES20

20 T

单片段一步克隆，已发文章累计IF达到1000+

Hieff Clone®Plus One Step Cloning Kit一步法快速克隆试剂盒

10911ES20/50

20 T/50 T

1-6片段一步克隆，最快5分钟完成重组反应

Hieff Clone®Universal One Step Cloning Kit通用型一步法快速克隆试剂盒

10922ES20/50

20 T/50 T

参考文献

1.Barany F.Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(1),189-193.

2.Holton TA,Graham MW.A Simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors[J].Nucleic AcidsＲes,1991,19(5),1156.

3.Clark D P,Pazdernik N J,Mcgehee M R.Cloning Genes for Synthetic Biology-ScienceDirect[J].Molecular Biology(Third Edition),2019:199-239.

4.Seki T,Seki M,OnoderaＲ,et al.Cloning of cDNA encoding a novel mouse DNA topoisomerase III(Topo IIIbeta)possessing negatively supercoiled DNA relaxing activity,whose message is highly expressed in the testis[J].J Biol Chem,1998,273(44):28553-28556.

5.Gibson DG,Young L,ChuangＲY,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J].Nat Methods,2009,6(5):343-345.

6.张阳璞,杨淑慎.几种新型植物基因表达载体的构建方法[J].生物工程学报,2015,31(03):311-327.